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C-N鍵廣泛存在于活性天然產(chǎn)物、藥物分子之中，構(gòu)建C-N鍵也成了廣大化學(xué)工作者研究的重點(diǎn)方向。在諸多構(gòu)建C-N鍵的方法中，對(duì)有機(jī)分子中最廣泛存在的C-H鍵進(jìn)行胺化，無(wú)疑是最為直接、高效的方法之一。然而已有的C-H鍵胺化策略嚴(yán)重依賴于昂貴的過(guò)渡金屬，成本高且環(huán)境不友好，開(kāi)發(fā)更為綠色的反應(yīng)體系則顯得十分重要。美國(guó)加州理工學(xué)院的化學(xué)家Frances Arnold教授在此領(lǐng)域已經(jīng)取得了一系列進(jìn)展，她們開(kāi)發(fā)了酶催化的分子內(nèi)C-H鍵胺化反應(yīng)（J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 15505-15508；Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 125, 9479-9482）。相比之下，分子間不對(duì)稱的C-H鍵胺化較分子內(nèi)的反應(yīng)難度更大，雖然已有一些銠、釕、錳金屬催化體系報(bào)道，然而迄今為止尚無(wú)廉價(jià)易得的催化劑能有效實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程。而且，科學(xué)家也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有任何一種自然界中的酶可以催化這一反應(yīng)。

近日，F(xiàn)rances Arnold教授再做突破，她領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)定向進(jìn)化方法發(fā)現(xiàn)了一種基于細(xì)胞色素P450單加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase）的工程酶，這種包含鐵-血紅素輔基的工程酶可以高效催化分子間芐位不對(duì)稱C-H鍵胺化反應(yīng)。該工作發(fā)表在近期的Nature Chemistry 上，Christopher Prier 和Ruijie Zhang 為共同第一作者。

Frances Arnold教授。圖片來(lái)源：California Institute of Technology

用酶來(lái)催化有機(jī)反應(yīng)并不新鮮，F(xiàn)rances Arnold教授堪稱這一領(lǐng)域內(nèi)的“女神”級(jí)人物。她課題組2016年一篇“酶法構(gòu)建C-Si鍵”的Science 工作，讓不少人驚呼構(gòu)建“硅基生命”終于成為可能（Science, 2016, 354, 1048-1051，點(diǎn)擊閱讀詳細(xì)），這一發(fā)現(xiàn)也入選了美國(guó)化學(xué)會(huì)C&EN 評(píng)選出的“2016年頂級(jí)科研成果”（點(diǎn)擊閱讀詳細(xì)）。

Arnold教授團(tuán)隊(duì)之前研究分子內(nèi)C-H鍵胺化反應(yīng)的工作，所用的是細(xì)胞色素P450單加氧酶的突變體——Arnold教授稱其為細(xì)胞色素P411。很自然地，Arnold教授團(tuán)隊(duì)設(shè)想這些細(xì)胞色素P411或許可以用于催化分子間C-H鍵胺化（下圖）：首先細(xì)胞色素P411的血紅素輔基被還原為形成二價(jià)鐵狀態(tài)1，此后1與TsN3反應(yīng)形成鐵nitrenoid中間體2，2與烷基底物3反應(yīng)形成C-H鍵胺化的產(chǎn)物4并重生催化劑1。根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)，反應(yīng)中可能存在競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程，中間體2會(huì)發(fā)生降解形成磺酰胺副產(chǎn)物5。以往工作已經(jīng)證明，細(xì)胞色素P411能夠高效催化分子內(nèi)C-H鍵胺化反應(yīng)，原因是在分子內(nèi)反應(yīng)中，參與反應(yīng)的C-H鍵與形成的nitrenoid中間體2距離較近，一定程度上有利于反應(yīng)進(jìn)行。然而，在分子間C-H鍵胺化反應(yīng)中，底物與nitrenoid中間體2距離較遠(yuǎn)。因此為了保證C-H鍵胺化反應(yīng)順利進(jìn)行，nitrenoid中間體2需具有非常高的反應(yīng)活性，使得分子間C-H鍵胺化反應(yīng)的速率高于中間體降解的速率。

細(xì)胞色素P411催化分子間不對(duì)稱C-H胺化的設(shè)想機(jī)理。圖片來(lái)源：Nature Chem.

不過(guò)，實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻不讓人滿意，幾乎所有已知的細(xì)胞色素P411——包括那些對(duì)分子內(nèi)C-H鍵胺化及分子內(nèi)氮雜環(huán)丙烷化反應(yīng)具有很高催化活性的工程酶，對(duì)分子間C-H鍵胺化都沒(méi)有任何催化活性，只是生成了相應(yīng)的磺酰胺副產(chǎn)物。不過(guò)事無(wú)絕對(duì)，她們發(fā)現(xiàn)原本設(shè)計(jì)用于酰亞胺化反應(yīng)的一種P411突變體——P411BM3 P-4具有微弱的活性，收率11%，e.e. 值14%。隨后她們針對(duì)P-4進(jìn)行了定向進(jìn)化，經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的篩選終于發(fā)現(xiàn)一種突變體P411CHA（cytochrome P411 C-H aminase）具有最好的催化活性和選擇性（下圖）。

工程酶的定向進(jìn)化。圖片來(lái)源：Nature Chem.

后續(xù)的研究中，作者發(fā)現(xiàn)P411CHA催化分子間不對(duì)稱C-H鍵胺化反應(yīng)的TON（turnover number）可高達(dá)1300，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于過(guò)渡金屬催化分子間不對(duì)稱C-H鍵胺化反應(yīng)的催化效率（目前報(bào)道的最高TON為85）。她們隨后對(duì)P411CHA催化反應(yīng)進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，得到最優(yōu)條件，反應(yīng)在水中、室溫條件下進(jìn)行，胺化產(chǎn)物4的收率高達(dá)86%，對(duì)映選擇性很好（e.e. > 99%），TON為670

接下來(lái)是底物適用性研究。下圖中已列出大部分可以反應(yīng)的底物，可以看出，目前該體系具有較大的底物局限性，吸電基團(tuán)取代的底物產(chǎn)率很低。然而該體系也具有一定的優(yōu)勢(shì)，例如產(chǎn)物對(duì)映選擇性高、TON高等。

反應(yīng)對(duì)底物的電性非常敏感（富電子底物產(chǎn)率較高），表明該反應(yīng)中C-H鍵插入為決速步，氘代實(shí)驗(yàn)（下圖a，KH/KD = 1.6）進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。富電子底物反應(yīng)產(chǎn)率高有兩種可能的原因：（1）相應(yīng)的酶催化劑具有高C-H鍵胺化催化活性；（2）相應(yīng)的酶催化劑一定程度上抑制了nitrenoid中間體降解的副反應(yīng)。

通過(guò)對(duì)P411CHA酶結(jié)構(gòu)的研究（上圖b），她們發(fā)現(xiàn)P411CHA具有高效催化活性的原因在于酶較好地調(diào)節(jié)了活性氮物種與烷烴底物的交互作用，P411CHA具有合適的血紅素遠(yuǎn)端口袋體積，底物通過(guò)范德華力與A87、L263、E267和V328等相結(jié)合，使得C-H鍵與氮賓距離較近，從而使分子間C-H鍵胺化反應(yīng)得以高效進(jìn)行。

——總結(jié)——

Frances Arnold教授課題組發(fā)現(xiàn)一種包含鐵-血紅素輔基的工程酶——細(xì)胞色素P411CHA對(duì)分子間芐位不對(duì)稱C-H鍵胺化反應(yīng)具有高度的催化活性。盡管底物適用范圍有限，但反應(yīng)具有非常明顯的優(yōu)點(diǎn)，即產(chǎn)物的對(duì)映選擇性高、TON高。另外，這種工程酶還有望用于更多目前化學(xué)催化不能實(shí)現(xiàn)的C-H鍵官能團(tuán)化反應(yīng)。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有酶催化劑進(jìn)行改進(jìn)，人們有望解決一些傳統(tǒng)合成化學(xué)的難題，甚至挑戰(zhàn)目前化學(xué)催化無(wú)法實(shí)現(xiàn)的化學(xué)轉(zhuǎn)化。